A NEW PCR-RFLP METHOD FOR THE IDENTIFICATION OF PARENTAL AND HYBRIDOGENETIC WESTERN EUROPEAN WATER FROGS INCLUDING THE Pelophylax perezi-grafi SYSTEM Angélica Cuevas, Cécile Patrelle, François Ciavatti, Thomas Gendre, Patricia Sourrouille, Philippe Geniez, Paul Doniol-Valcroze & Pierre-André Crochet Corresponding authors: Angélica Cuevas, angelica.cuevas@evobio.eu; Paul Doniol-Valcroze, pauldoniol-valcroze@orange.fr. NTF3 nuclear marker alignment. The restriction site for the enzyme used (Xapl) is aligned with the sequences and its restriction site is indicated in lower case on the first sequence. Pelophylax_ridibundus_T6127 CCACCATGGA TAAGAGGAAT TTGCCCGAAA ACTCAATTAA TTCTTTCTTT ATAAAGCTCA TGCAAGACGA CCTCGTAAAA [ 80] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... .......... .......... .......K.. .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_ridibundus_T6123 .......... .......... .......... .......G.. .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_ridibundus_T6124 .......... .......... .......... .......K.. .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_ridibundus_T6169 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_lessonae_AHA3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_lessonae_AHA5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_lessonae_COR500 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_lessonae_ROU459 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_lessonae_SER518 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_perezi_RIO1101 .......... .......... .......... .......G.. .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_perezi_RIO706 .......... .......... .......... .......G.. .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_perezi_BEV.9912 .......... .......... .......... .......G.. .......... .......... .......... ....N..... [ 80] Pelophylax_perezi_T6156 .......... .......... .......... .......K.. .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_perezi_T6157 .......... .......... .......... .......G.. .......... .......... .......... ....N..... [ 80] Pelophylax_perezi_T6158 .......... .......... .......... .......K.. .......... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_ridibundus_T6127 AATAAAGCTT CCAAGCAGGT GGCCAACACC AAGGAAAACC ACCAGCAAAA TACAATACCA AAAGCAGAAA TCCTTGTTGA [160] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_ridibundus_T6123 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_ridibundus_T6124 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_ridibundus_T6169 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_lessonae_AHA3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_lessonae_AHA5 .......... ....N..... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_lessonae_COR500 .......... ....A..... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_lessonae_ROU459 .......... ....A..... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_lessonae_SER518 .......... ....A..... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_perezi_RIO1101 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_perezi_RIO706 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_perezi_BEV.9912 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_perezi_T6156 .......... ....N..... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_perezi_T6157 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_perezi_T6158 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_ridibundus_T6127 CTTGGATATG GTCGATGACA GCCTTGAAAG TGGGAAATCA GACTTTCAGC CGGTTCACTC ATTGGAAGCA GAACTATTTA [240] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... ..Y....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_ridibundus_T6123 .......... ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_ridibundus_T6124 .......... ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_ridibundus_T6169 .......... ..N....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_lessonae_AHA3 .......... ..N....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_lessonae_AHA5 .......... ..N....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_lessonae_COR500 .......... ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_lessonae_ROU459 .......... ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_lessonae_SER518 .......... ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_perezi_RIO1101 .......... ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_perezi_RIO706 .......... ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_perezi_BEV.9912 .......... ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_perezi_T6156 .......... ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_perezi_T6157 .......... ..T....... .......... .......... N......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_perezi_T6158 .......... ..T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_ridibundus_T6127 AGCATCAGCG TCAGAGACGT TATAATTCGC CGCGTGTGCT TTTGAGCGGC AACTTACCCA TGGAACCTCC ACCCTTGTAT [320] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_ridibundus_T6123 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_ridibundus_T6124 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_ridibundus_T6169 .......... N......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_lessonae_AHA3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_lessonae_AHA5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_lessonae_COR500 .......... .......... .......... ........T. .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_lessonae_ROU459 .......... .......... .......... ........T. .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_lessonae_SER518 .......... .......... .......... ........N. .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_perezi_RIO1101 .......... N......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_perezi_RIO706 .......... N......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_perezi_BEV.9912 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_perezi_T6156 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_perezi_T6157 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_perezi_T6158 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_ridibundus_T6127 CTAATGGATG ACTTTGTGGG ACACTCTCCC TCAACGAACA GGACGTCAAG GAGGAAAAGG TACGCAGAGC ACAGGGGCCA [400] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_ridibundus_T6123 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_ridibundus_T6124 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_ridibundus_T6169 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_lessonae_AHA3 .......... .......... ...N...... .......... .......... .......... ........N. .......... [400] Pelophylax_lessonae_AHA5 .......... .......... ...N...... .......... .......... .......... ........N. .......... [400] Pelophylax_lessonae_COR500 .......... .......... ...T...... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_lessonae_ROU459 .......... .......... ...T...... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_lessonae_SER518 .......... .......... ...T...... .......... .......... .......... ........N. .......... [400] Pelophylax_perezi_RIO1101 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_perezi_RIO706 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_perezi_BEV.9912 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_perezi_T6156 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_perezi_T6157 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......N... .......... [400] Pelophylax_perezi_T6158 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Xapl RAA TTY Pelophylax_ridibundus_T6127 CCGGGGAgaa tttTCTGTGT GCGACAGCGA GAGCTTATGG GTCACAGACA AGTCGAATGC CATTGACATT CGGGGGCACC [480] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_ridibundus_T6123 .........G .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_ridibundus_T6124 .........R .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_ridibundus_T6169 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_lessonae_AHA3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_lessonae_AHA5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_lessonae_COR500 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_lessonae_ROU459 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_lessonae_SER518 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_perezi_RIO1101 .........G .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_perezi_RIO706 .........G .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_perezi_BEV.9912 .........G .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_perezi_T6156 .........R .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_perezi_T6157 .........G .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_perezi_T6158 .........R .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_ridibundus_T6127 AAGTAACTGT TTTGGGGGAA ATTAAGTCTG GCAATTCACC GGTCAAGCAA TATTTTTACG AGACAAGATG TAAGGATGCG [560] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_ridibundus_T6123 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_ridibundus_T6124 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_ridibundus_T6169 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_lessonae_AHA3 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_lessonae_AHA5 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........N [560] Pelophylax_lessonae_COR500 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........A [560] Pelophylax_lessonae_ROU459 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........A [560] Pelophylax_lessonae_SER518 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........A [560] Pelophylax_perezi_RIO1101 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_perezi_RIO706 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_perezi_BEV.9912 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_perezi_T6156 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_perezi_T6157 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_perezi_T6158 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_ridibundus_T6127 AGGCCGGTCA AAAACGGATG CCGAGGCAT [589] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... .......... ......... [589] Pelophylax_ridibundus_T6123 .......... .......... ......... [589] Pelophylax_ridibundus_T6124 .......... .......... ......... [589] Pelophylax_ridibundus_T6169 .......... .......... ......... [589] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... .......... ......... [589] Pelophylax_lessonae_AHA3 .......... .......... ...N..... [589] Pelophylax_lessonae_AHA5 .......... .......... ...N..... [589] Pelophylax_lessonae_COR500 .......... .......... ...G..... [589] Pelophylax_lessonae_ROU459 .......... .......... ...G..... [589] Pelophylax_lessonae_SER518 .......... .......... ...G..... [589] Pelophylax_perezi_RIO1101 .......... .......... ......... [589] Pelophylax_perezi_RIO706 .......... .......... ......... [589] Pelophylax_perezi_BEV.9912 .......... .......... ......... [589] Pelophylax_perezi_T6156 .......... .......... ......... [589] Pelophylax_perezi_T6157 .......... .......... ......... [589] Pelophylax_perezi_T6158 .......... .......... ......... [589]