A NEW PCR-RFLP METHOD FOR THE IDENTIFICATION OF PARENTAL AND HYBRIDOGENETIC WESTERN EUROPEAN WATER FROGS INCLUDING THE Pelophylax perezi-grafi SYSTEM Angélica Cuevas, Cécile Patrelle, François Ciavatti, Thomas Gendre, Patricia Sourrouille, Philippe Geniez, Paul Doniol-Valcroze & Pierre-André Crochet Corresponding authors: Angélica Cuevas, angelica.cuevas@evobio.eu; Paul Doniol-Valcroze, pauldoniol-valcroze@orange.fr. TYR1 nuclear marker alignment. The restriction site for the enzyme used (BAL I) is aligned with the sequences and its restriction site is indicated in lower case on the first sequence. Pelophylax_perezi_BEV.12104 TTGCCCAGTC TGGCCAGGAG ATAATTCTTC ATGTGGAGAA GTCTCNGGCA GGGGAGTGTG CCAAGATGTT GTCCCCTCCA [ 80] Pelophylax_perezi_BEV.12086 .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_perezi_BEV.12090 .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .......... ..N....... [ 80] Pelophylax_perezi_BEV.12091 .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_perezi_BEV.12103 .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .......... .......... [ 80] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .........A .......... [ 80] Pelophylax_ridibundus_BEV.12095 .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .........A .......... [ 80] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .........A .......... [ 80] Pelophylax_ridibundus_BEV.8216 .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .........A .......... [ 80] Pelophylax_ridibundus_BEV.892 .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .........A .......... [ 80] Pelophylax_ridibundus_BEV.11706 .......... .......... .......... .......... .....A.... .......... .........A .......... [ 80] Pelophylax_ridibundus_BEV.11705 .......A.. .......... .......... .......... .....A.... .......... .........A .......... [ 80] Pelophylax_lessonae_BEV.11361 ........C. .......... .......... .......... .....A.... .......... .........A .......... [ 80] Pelophylax_lessonae_BEV.11362 ........C. .......... .......... .......... .....A.... .......... .........A .......... [ 80] Pelophylax_lessonae_BEV.12376 ........C. .......... .......... .......... .....A.... .......... .........A .......... [ 80] Pelophylax_lessonae_BEV.12379 ........C. .......... .......... .......... .....A.... .......... .........A .......... [ 80] Pelophylax_lessonae_BEV.11370 ........C. .......... .......... .......... .....A.... .......... .........A .......... [ 80] Pelophylax_perezi_BEV.12104 ACTCCCCAGT GGGTGCCCAA TTCCCTTTCT CAGGCATTGA TGACCGAGAA AACTGGCCCA TTGTCTTCTA CAACAGGACA [160] Pelophylax_perezi_BEV.12086 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_perezi_BEV.12090 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_perezi_BEV.12091 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_perezi_BEV.12103 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... .......... .......... .G........ .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_ridibundus_BEV.12095 .......... .......... .......... .G........ .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... .......... .......... .G........ .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_ridibundus_BEV.8216 .......... .......... .......... .G........ .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_ridibundus_BEV.892 .......... .......... .......... .G........ .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_ridibundus_BEV.11706 .......... .......... .......... .G........ .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_ridibundus_BEV.11705 .......... .......... .......... .G........ .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_lessonae_BEV.11361 .......... .......... .......... .G........ .......... .......... .......... .........M [160] Pelophylax_lessonae_BEV.11362 .......... .......... .......... .G........ .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_lessonae_BEV.12376 .......... .......... .......... .G........ .......... .......... .......... .......... [160] Pelophylax_lessonae_BEV.12379 .......... .......... .......... .G........ .......... .......... .......... .........M [160] Pelophylax_lessonae_BEV.11370 .......... .......... .......... .G........ .......... .......... .......... .........M [160] Pelophylax_perezi_BEV.12104 TGCCAATGCC AGGGTAACTT CATGGGCTAC AACTGCGGTG AGTGCAGGTT TGGCTACACA GGACCAAACT GCACCGTTAG [240] Pelophylax_perezi_BEV.12086 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_perezi_BEV.12090 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_perezi_BEV.12091 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........NN [240] Pelophylax_perezi_BEV.12103 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....N.... [240] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... .......... .......... .....N.... .......... .......... ........T. .......... [240] Pelophylax_ridibundus_BEV.12095 .......... .......... .......... .....T.... .......... .......... ........T. .......... [240] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... .......... .......... .....T.... .......... .......... .....N..N. .......... [240] Pelophylax_ridibundus_BEV.8216 ....G..... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. .......... [240] Pelophylax_ridibundus_BEV.892 .......... .......... .......... .....T.... .......... .......... .......... .......... [240] Pelophylax_ridibundus_BEV.11706 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. .......... [240] Pelophylax_ridibundus_BEV.11705 ....G..... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. .......... [240] Pelophylax_lessonae_BEV.11361 .....R.... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. .......... [240] Pelophylax_lessonae_BEV.11362 .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. .......... [240] Pelophylax_lessonae_BEV.12376 .....R.... .......... .......... .......... ......A... .......... ........T. .......... [240] Pelophylax_lessonae_BEV.12379 .....R.... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. .......... [240] Pelophylax_lessonae_BEV.11370 .....R.... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. .......... [240] Bal I TGGCCA Pelophylax_perezi_BEV.12104 ACNCAACATG ATCAGAAAGG AAATCTTCAG GATGACCACG GCTGAGAAGG ACAAGTTCAT TGCCTACCTC AACTtggcca [320] Pelophylax_perezi_BEV.12086 N.G....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_perezi_BEV.12090 ..G....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_perezi_BEV.12091 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_perezi_BEV.12103 N.G....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [320] Pelophylax_ridibundus_T6126 ..A....C.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. [320] Pelophylax_ridibundus_BEV.12095 ..A....C.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. [320] Pelophylax_ridibundus_T6170 ....NN.N.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. [320] Pelophylax_ridibundus_BEV.8216 ..G..C.C.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. [320] Pelophylax_ridibundus_BEV.892 ..G..C.C.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. [320] Pelophylax_ridibundus_BEV.11706 ..A..C.C.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. [320] Pelophylax_ridibundus_BEV.11705 ..G....C.. .......... .......... A......... .......... .......... .......... ........T. [320] Pelophylax_lessonae_BEV.11361 ..G...TC.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......ST. [320] Pelophylax_lessonae_BEV.11362 ..G...TC.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. [320] Pelophylax_lessonae_BEV.12376 ..G..MYC.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......ST. [320] Pelophylax_lessonae_BEV.12379 ..G....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......ST. [320] Pelophylax_lessonae_BEV.11370 ..G...YC.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. [320] Pelophylax_perezi_BEV.12104 AACGTACCAT CAGCCAGGAC TACNTTATTG CCACCGGCAC TTACGAGCAG ATGAACAATG GCTCCAATCC GATGTTCGCA [400] Pelophylax_perezi_BEV.12086 .......... .......... ...G...... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_perezi_BEV.12090 .......... .......... ..NG...... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_perezi_BEV.12091 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_perezi_BEV.12103 .......... .......... ...G...... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... .......... ...G...... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_ridibundus_BEV.12095 ....N..... .......... ...G...... .......... .......... .......... .......... A......... [400] Pelophylax_ridibundus_T6170 ....N..... ..N.N..... ...G...... .......... ...NN..... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_ridibundus_BEV.8216 .......... .......... ...G...... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_ridibundus_BEV.892 .......... .......... ...G...... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_ridibundus_BEV.11706 .......... .......... ...G...... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_ridibundus_BEV.11705 .......... .......... ...G...... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_lessonae_BEV.11361 .R........ .......... ..YG.....K .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_lessonae_BEV.11362 .......... .......... ...G...... .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_lessonae_BEV.12376 .R........ .......... ..YG.....K .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_lessonae_BEV.12379 .R........ .......... ..YG.....K .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_lessonae_BEV.11370 .R........ .......... ..YG.....K .......... .......... .......... .......... .......... [400] Pelophylax_perezi_BEV.12104 GATATCAATG TCTATGATCT GTTTGTGTGG TTGCATTACT ACGCCTCCAG AGATGCTTTC TTGGAAGATG GCAGTGTGTG [480] Pelophylax_perezi_BEV.12086 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_perezi_BEV.12090 ...N...... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_perezi_BEV.12091 N..N...... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_perezi_BEV.12103 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_ridibundus_T6126 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_ridibundus_BEV.12095 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... .N........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_ridibundus_BEV.8216 .......... .T........ .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_ridibundus_BEV.892 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_ridibundus_BEV.11706 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .T........ [480] Pelophylax_ridibundus_BEV.11705 .......... ........T. .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_lessonae_BEV.11361 .......... .......... .......... .......... .Y........ .......... .......... .Y........ [480] Pelophylax_lessonae_BEV.11362 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_lessonae_BEV.12376 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_lessonae_BEV.12379 .......... .......... .......... .......... ....M..... .......... .......... .......... [480] Pelophylax_lessonae_BEV.11370 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .Y........ [480] Pelophylax_perezi_BEV.12104 GGCCAACATA GACTTTGCCC ATGATGCTCC TGGCTTTCTG CCTTGGCACA GGTTCTTTCT GCTGCTTTGG GAACGAGAAA [560] Pelophylax_perezi_BEV.12086 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_perezi_BEV.12090 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_perezi_BEV.12091 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_perezi_BEV.12103 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_ridibundus_T6126 ......NNNN N......... .......... ........NN .......... N.NNNN.... .......... .......... [560] Pelophylax_ridibundus_BEV.12095 .......... .......... .......... ........NN .......... .......... .......... .......... [560] Pelophylax_ridibundus_T6170 .......... .......... .......... ........NN .......... N.NNNN.... ....N..... .......... [560] Pelophylax_ridibundus_BEV.8216 .......... .......... .......... .........A .......... ..A....... .......... .......... [560] Pelophylax_ridibundus_BEV.892 .......... .......... .......... .........A .......... ..A....... ....A..... .......... [560] Pelophylax_ridibundus_BEV.11706 .........T .......... .......... .......... .......... ..A....... .......... .......... [560] Pelophylax_ridibundus_BEV.11705 .......... .......... .......... .........A .......... .......... ....A..... .......... [560] Pelophylax_lessonae_BEV.11361 .........W .......... ....K..... ........Y. .......... ..A....... .......... .......... [560] Pelophylax_lessonae_BEV.11362 .........T .......... .......... .......... .......... ..A....... .......... .......... [560] Pelophylax_lessonae_BEV.12376 .........W .......... .......... Y.......Y. .......... ..A....... .......... .......... [560] Pelophylax_lessonae_BEV.12379 .........W .......... .......... .......... .......... ..A....... .......... .......... [560] Pelophylax_lessonae_BEV.11370 .........T .......... .......... .......... .......... ..A....... .......... .......... [560] Pelophylax_perezi_BEV.12104 TCCAGAAGGC GACTGCGGAT GATAATTTTA CTATTCCCTA T [601] Pelophylax_perezi_BEV.12086 .......... .......... .......... .......... . [601] Pelophylax_perezi_BEV.12090 .......... .......... .......... .......... . [601] Pelophylax_perezi_BEV.12091 .......... .......... .......... .......... . [601] Pelophylax_perezi_BEV.12103 .......... .......... .......... .......... . [601] Pelophylax_ridibundus_T6126 .........T .G.A...... ..C....... .........T . [601] Pelophylax_ridibundus_BEV.12095 .........T .NNNN..... .......... .........T . [601] Pelophylax_ridibundus_T6170 .N.N.....T .N.NN....N ..N....... .......NNT N [601] Pelophylax_ridibundus_BEV.8216 .........T ...A...... ..C....... .........T C [601] Pelophylax_ridibundus_BEV.892 .........T ...A...... .......... .........T . [601] Pelophylax_ridibundus_BEV.11706 .........T ...A...... ..C....... .........T . [601] Pelophylax_ridibundus_BEV.11705 .........T .G........ .......... .........T C [601] Pelophylax_lessonae_BEV.11361 .........T .G.W...... ..C....... .........T . [601] Pelophylax_lessonae_BEV.11362 .........T .G.A...... ..C....... .........T . [601] Pelophylax_lessonae_BEV.12376 .........T .G.W...... ..C....... .........T C [601] Pelophylax_lessonae_BEV.12379 .........T .G.A...... ..C....... .........T C [601] Pelophylax_lessonae_BEV.11370 .........T .G.A...... ..C....... .........T C [601]